ЗАТВЕРДЖЕНО
наказом МОЗ України
від 30.05.1997 р. N 167
Інструкція
по організації та проведенню
протихолерних заходів, клініці та лабораторній діагностиці холери
6. Поживні середовища для виділення та ідентифікації холерних вібріонів.
6.1. Транспортні середовища:
6.1. Транспортні середовища:
- 1 % пептонна вода, pH 8,5+/-0,1, без інгібіторів росту сторонньої флори і з телуритом калію (див. середовища збагачення);
- 2 % розчин повареної солі: 20 г хлориду натрію і 0,1 г їдкого натрію розчиняють в 1 л дистильованої води; рідину фільтрують через паперовий фільтр, розливають по 10 мл в пробірки і стерилізують в автоклаві 20 хвилин при 0,7 атм.
6.2. Середовища збагачення.
6.2.1. Основний розчин пептону готують по наступному рецепту:
Пептон - 100 г
Хлорид натрію - 50 г
Нітрат калію - 1 г
Карбонат натрію - 25 г
Дистильована вода - 1 л
pH 8,4+/-0,2
У холодну дистильовану воду вносять пептон, хлорид і карбонат натрію. Суміш кип'ятять при постійному помішуванні до повного розчину пептону, потім дають нітрат калію. Перевіряють реакцію середовища, якщо потрібно, pH доводять до 8,4+/-0,2. Розчин фільтрують через міткалевий або паперовий фільтр, розливають в посуду і стерилізують в автоклаві при 1 атм 20 хвилин.
Основний розчин пептону зберігається 2 роки.
6.2.2. 1 % пептонна вода. Для отримання 1 % пептонної води концентрований розчин розводять в 10 разів дистильованою водою.
Після встановлення pH 8,4+/-0,2 розливають в пробірки або флакони і стерилізують під тиском 0,7 атм 20 хвилин. 1 % пептонну воду можна готувати безпосередньо із окремих компонентів, для цього потрібно взяти вагу в 10 раз меншу ніж в рецепті основного пептону. Технологія приготування така ж, як і основного пептону.
6.2.3. Елективні середовища збагачення.
Пептонна вода з телуритом калію. В 1 % пептонну воду (pH 8,5+/-0,1) після автоклавування додають телурит калію в кінцевому розчині 1:100000 або 1:200000. Передчасно готують робочий 0,1 % розчин телуриту калію.
Термін зберігання робочого розчину 7 днів, а поживних середовищ з телуритом - не більше 48 годин при умові їх зберігання в холодильнику.
6.3. Тверді середовища для виділення холерного вібріону.
6.3.1. Лужні середовища.
Лужний м'ясо-пептонний агар:
М'ясна вода - 1 л
Пептон - 10 г
Хлорид натрію - 5 г
Агар-агар - 20 г
pH 7,8,0+/-0,2
В м'ясну воду вносять пептон і хлорид натрію. Суміш перемішують і підлужують 20 % розчином їдкого натрію до pH 8,3+/-0,1. Потім додають агар-агар і ставлять в автоклав для варіння середовища спочатку текучою парою на протязі 30-40 хвилин при 1 атм. 20 хвилин. Якщо м'ясо-пептонний агар варять на плиті, середовище кип'ятять до повного розплавлення агар-агару при постійному помішуванні.
Для одержання прозорого агарового середовища його після варіння з метою відстою на 2-3 години залишають в автоклаві або поміщають в термостатну кімнату при температурі 43 о C, можна продовжити до 18-20 - годин. В цей час грубі частини випадають в осад і агар освітлюється. Для запобігання швидкого остудження середовища посуд з агаром щільно обгортають ковдрою. Агар, який відстоявся, обережно, не змішуючи, сифоном або через край повільно зливають з осаду на щільний ватно-марлевий фільтр. У фільтраті уточнюють реакцію середовища, якщо потрібно, підкислюють її, але підлужувати агар на цьому етапі не рекомендується, тому що випадає осад при стерилізації готового середовища. Профільтрований агар розливають в посуд і стерилізують при 0,7 атм 20 хв. Лужний агар сухий:
- на основі ферментативного пептону з дріжджевим екстрактом;
- агар - лужний сухий - на поживній основі із казеїнового або дріжджового гідролізату;
- на поживній основі із гідролізату кормових дріжджів, повністю розчинений (засіб приготування вказаний на етикетці).
6.4. Середовища для ідентифікації вібріонів.
6.4.1. Середовища з вуглеводами.
Лактозо-сахарозне середовище.
Пептон - 5 г
Хлорид натрію - 5 г
Лактоза - 10 г
Сахароза - 1 г
Агар-агар - 10 г
Індикатор Андреде - 40 мл
Вода дистильована - 1 л
pH 7,3+/-0,1
Середовище варять, фільтрують, розливають по 5-7 мл в стерильні пробірки і стерилізують під тиском 0,5 атм 20 хв. Готове середовище після стерилізації скошують так, щоб одержати стовпчик і косяк (по типу середовища Ресселя). Середовище світле.
При відсутності пептону середовище готують на 1-1,3 % агарі Хотингера (з амінним азотом 50-60 мг %) чи іншому поживному агарі, додаючи до нього в відповідних концентраціях індикатор Андреде в кількості 2 % .
Середовище Кліглера:
1,5-1,7 % м'ясо-пептонний агар
або агар Мартена (pH 7,7+/-0,1) - 1 л
лактоза - 10 г
сахароза - 10 г
глюкоза - 1 г
2 % розчин сірчано-кислого
закисного заліза - 10 мл
0,8 % розчин тиосульфату
натрію - - 10 мл
0,4 % розчин сульфату натрію - 10 мл
1 % розчин фенолового червового - 24 мл
pH 7,3+/-0,1
На початку в розплавленому поживному агарі pH 7,7+/-0,1 розчиняють вуглеводи, потім до нього додають свіжоприготовлені розчини заліза і солі натрію згідно пропису середовища (індикатор на сірководень). Крім того, для реєстрації кислотоутворення додають індикатор феноловий червовий. Середовище варять, фільтрують, розливають по 5-7 мл в стерильні пробірки, стерилізують 20 хв. під тиском 0,5 атм і скошують по типу середовища Ресселя.
pH готового середовища (7,3+/-0,1).
Середовище Ресселя.
Готується так як лактозо-сахарозне середовище, але замість сахарози беруть глюкозу в тій же кількості.
Середовище Гісса:
Пептон - 10 г
Хлорид натрію - 5 г
Вуглевод - 5-10 г
Дистильована вода - 1 л
Індикатор Андреде - 10 мл
або 1,6 % розчин
бромтимолового синього - 1 мл
pH 7,3+/-0,1
До 1 % пептонної води (pH 7,3+/-0,1) без селітри додають 0,5-1 % необхідного вуглеводу або спирту (L-арабіноза, D-маноза, D-сахароза, D-маніт, L-інозіт, D-глюкоза та інш.) і 1 % індикатору Андреде або 0,1 мл 1,6 % розчину бромтимолового синього на 100 мл середовища. Середовище розливають в стерильні пробірки з поплавками і стерилізують при 0,5 атм 20 хв.; середовище з L-арабінозою слід стерилізувати протягом 20 хв. при 0,1-0,2 атм. Для приготування середовищ Гісса можна застосувати тільки перераховані ізомери вуглеводів. Готові середовища Гісса з індикатором Андреде світлі, при кислотоутворенні - червоніють, середовища з бромтимоловим синім - зеленого кольору з трав'янистим відтінком, при кислій реакції - жовтого кольору, при лужній - синього.
Середовище Хью-Лейфсона:
Пептон - 2 г
Хлорид натрію - 5 г
Двозаміщений фосфат калію - 0,3 г
Глюкоза - 10 г
Бромтимоловий синій - 0,03 г
Агар-агар - 3 г
Дистильована вода - 1 л
pH 7,1+/-0,1
До води додають пептон, хлористий натрій і агар-агар. Суміш підігрівають до розплавлення агару, потім вносять фосфат калію і глюкозу, продовжують кип'ятить 2-3 хв. Суміш підлужують 20 % розчином їдкого натрію до pH 7,4+/-0,1, доводять об'єм середовища до першопочаткового і додають 3 мл 1 % водного розчину бромтимолового синього. Потім середовище фільтрують через ватно-марлевий фільтр, розливають по 4-5 мл в стерильні пробірки і стерилізують під тиском 0,5 атм 20 хв. Колір середовища до стерилізації синій, а після автоклавування трав'янисто-зелений (pH 7,1+/-0,1), але не жовтий. При кислій реакції середовище жовтіє.
Бульйон Кларка:
Пептон - 5 г
Глюкоза - 5 г
Двохзаміщений фосфат калію - 5 г
Дистильована вода - 1 л
Суміш інгредієнтів нагрівають до повного їх розчинення, потім фільтрують через паперовий фільтр і розливають
по 5 мл в стерильні пробірки. Бульйон стерилізують під тиском 0,5 атм 20 хв.
Середовище з крохмалем і індикатором.
В 1 % пептонну воду для кольорового ряду додають 1 % розчинного крохмалю і 1 % індикатора Андреде. Середовище
розливають в стерильні пробірки і стерилізують 20 хв. при 0,5 атм. Середовище світле, при наявності кислоти червоніє.
6.4.2. Середовище для вивчення розщеплення білка.
Желатин. До м'ясо пептонного бульйону або бульйону Хотингера додають дрібно нарізаний желатин із розрахунку 10-15 г на 100 мл (улітку концентрацію желатину збільшують до 20 %). Желатину дають набухнути на протязі 30 хв. і потім розчинитися при повільному нагріванні на водяній бані при температурі (45+/-0,5 о C). Установлюють pH 7,1+/-0,1, додаючи до розплавленого желатину 10 % розчин вуглекислого натрію. При більш лужній реакції желатин застигає погано, а іноді і зовсім не застигає. В 1 л розчиненого желатину вносять для просвітлення 2 збитих з невеликою кількістю дистильованої води яєчних білків. Суміш перемішують і прогрівають текучим паром на протязі 20 хв. до повного згортання білка і просвітління середовища. Потім середовище фільтрують в гарячому стані через паперовий або ватномарлевий фільтр з великою поверхнею. Середовище, розлите по 5-8 мл в пробірки, стерилізують роздрібнено 3 дні по годині текучим паром або одноразово під тиском 0,5 атм 20 хв. Після стерилізації середовище охолоджується погруженням пробірок в холодну воду в суворо вертикальному положенні, щоб верхня частина стовпчика при застиганні залишалась зовсім рівною.
6.4.3. Середовища для визначення декарбоксилаз і дигідролаз амінокислот.
Середовище пептонно-дріжджове:
Пептон - 5 г
Дріжджовий екстракт - 25 мл (сухий 3 г)
Глюкоза - 1 г
Хлорид натрію - 5 г
Карбонат натрію - 0,1 г
Бромтимоловий синій
(0,1 % розчин в 20 % спирті) - 45 мл (0,045 г сухого)
Амінокислота - 10-20 г
Дистильована вода - 1 л
pH 6,4+/-0,1
Середовище із сухих компонентів може бути приготовлене в сухому вигляді.
Всі інгредієнти по прописі вищевказаного середовища розчиняють при нагріванні, встановлюють pH 6,4+/-0,1, потім додають відповідний індикатор і ділять середовище на 4 рівні частина. В одну частину амінокислоти не додаються, ця порція служить контролем. В останні порції вносять відповідно: в першу - 1 % лізину, в другу - 1 % орнітину, в третю - 1 % аргініну. Амінокислоти повинні бути в L-формі, якщо D-амінокислоти, то додають 2 %, так як мікроорганізми активні тільки по відношенню до L-форм. Після додання амінокислот перед стерилізацією, в випадку необхідності, реакцію середовищ виправляють 0,1 % розчином соляної кислоти. Середовище розливають по 1-2 мл в хімічно чисті стерильні пробірки і стерилізують під тиском 0,1-0,2 атм 20 хв. Невелика кількість флокулята в середовищах не має значення. Пептонно-дріжджове середовище має трав'янисто-зелений колір, при кислій реакції середовище жовтіє, при лужній - синіє.
6.4.4. Приготування індикаторних папірців для виявлення утворення індолу і сірководню:
а) полоски фільтрувального паперу змочують насиченим водним розчином щавлевої кислоти і висушують в термостаті;
б) полоски фільтрувального паперу змочують розчином оцетокислого свинцю. Підсушують на повітрі.
Полоски індикаторних папірців занурюють під корок пробірки з засіяною культурою. В випадку утворення індолу полоски "а" червоніють, а при утворенні сірководню полоски "б" чорніють.
7. Засіб відбору колоній вібріонів за допомогою стереоскопічного мікроскопу в косопрохідному світлі.
Принцип методу полягає в тому, що при перегляді колоній різних мікробів під малим збільшенням мікроскопу або лупи при освітленні їх пучком світла, який косо падає на поверхню агару, колонії набувають здатності світитися і здаються забарвленими.
До стереоскопічного мікроскопу МБС-2 або МБС-1 прилаштовують пристрій для одержання вузького пучка світла і дзеркало від мікроскопу на рухомому шарнірі для освітлення чашки знизу під кутом 45 град.
При величині кута падіння променя світла на поверхність агару в 40-50 град. колонії вібріонів по своєму забарвленню помітно відрізняються від інших мікроорганізмів, чашки з посівами проглядають після 12-18 годин інкубації. Обладнання для проглядання колоній в косопрохідному світлі.
1. Столик стереоскопічного мікроскопу МБС-1 або МБС-2 заміняють спеціальним приладом для освітлення чашки знизу під кутом 45 град. Джерелом світла є освітлювач від мікроскопу, на який одягають кожух з отвором діаметром 5 мм проти спіралі лампочки для одержання вузького пучка світла. Вузький пучок світла направляють в центр увігнутого дзеркала, яке переміщується на рухливому шарнірі поворотом гвинта в залежності від необхідності кута падіння світла. Кут вичислюють по відношенню відстані від дзеркала до чашки, яке міняється довільно, і відстань від чашки до поверхні стола, яка залишається незмінною.
Для зручності дослідження освітлювач і дзеркало можна вмонтувати в ящик із скляною кришкою, на яку поміщають чашку з посівом. Це дає можливість швидко находити необхідний кут падіння світла, пересуваючи дзеркало поворотом гвинта по вмонтованій шкалі.
Колір колоній, які виросли на лужному агарі при косому освітленні
Мікроорганізм |
Колір колоній |
Холерні вібріони |
Переважає сіро-голубий з відтінком зеленувато-сірим, синювато-зеленим, рідше зелений з верхнім краєм червоно-бурого або коричневого відтінку |
Сальмонели |
Рожевий відтінок |
Шигели |
Рожевий з фіолетовим відтінком |
Кишкова паличка |
Яскраво-червоний |
Протей |
Червоний з фіолетовим відтінком |
2. Пристосування, змонтоване із основних вузлів стереоскопічного мікроскопу МБС-1 і приладу для рахування колоній. Із розтруба верхньої кришки прибору для відрахування колоній вилучити обидва скла разом з опорним кільцем і зняти верхню кришку. Із скоби передньої панелі вигвинтити вертикальну вісь, після чого вилучити диск із світлофільтрами. Звільнити два гвинти, які прикріплюють патрон лампочки освітлення до кронштейну на задній панелі. В кришку знизу вставити вертикальну штангу від вузла лупи з таким розрахунком, щоб в робочому положенні приладу муфта з притиснутим гвинтом була на дні під кронштейном імпульсного лічильника. В муфту зажати держак з вугловими губками (з комплекту лабораторного штативу), попередньо вкорочений до 110 мм. Держаком закріпити патрон з лампочкою в вертикальному положенні. Кришку фіксувати гвинтами на своєму звичному місці. Штатив мікроскопу МБС-1 разом з бінокулярною насадкою відокремити від столика і встановити безпосередньо на корпус приладу для підрахунку колоній так, щоб 3 сферичні ніжки основи штативу охватили розтруб кришки приладу, а вікно основи було повернуте до дослідника. Підготовлені до проглядання чашки з посівами встановлюють над відкритим вікном. Потрібну освітленість і кут падіння світла находять зміною положення лампи, яке досягається поверненням штанги, після чого останню фіксують цанговим затискачем.